Активные и регуляторные центры ферментов. Структурно-функциональная организация ферментов

Давно выяснено, что все ферменты являются белками и обладают всеми свойствами белков. Поэтому подобно белкам ферменты делятся на простые и сложные.

Простые ферменты состоят только из аминокислот – например, пепсин , трипсин , лизоцим .

Сложные ферменты (холоферменты ) имеют в своем составе белковую часть, состоящую из аминокислот – апофермент , и небелковую часть – кофактор . Примером сложных ферментов являются сукцинатдегидрогеназа (содержит ФАД), аминотрансферазы (содержат пиридоксальфосфат), пероксидаза (содержит гем), лактатдегидрогеназа (содержит Zn 2+), амилаза (содержит Ca2+ ).

Кофактор , в свою очередь, может называться коферментом (НАД+ , НАДФ+ , ФМН, ФАД, биотин) или простетической группой (гем, олигосахариды, ионы металлов Fe2+ , Mg2+ , Ca2+ , Zn2+ ).

Деление на коферменты и простетические группы не всегда однозначно:
если связь кофактора с белком прочная, то в этом случае говорят о наличии простетической группы ,
но если в качестве кофактора выступает производное витамина - то его называют коферментом , независимо от прочности связи.

Для осуществления катализа необходим полноценный комплекс апобелка и кофактора, по отдельности катализ они осуществить не могут. Кофактор входит в состав активного центра, участвует в связывании субстрата или в его превращении.

Как многие белки, ферменты могут быть мономерами , т.е. состоять из одной субъединицы, и полимерами , состоящими из нескольких субъединиц.

Структурно-функциональная организация ферментов

В составе фермента выделяют области, выполняющие различную функцию:

1. Активный центр – комбинация аминокислотных остатков (обычно 12-16), обеспечивающая непосредственное связывание с молекулой субстрата и осуществляющая катализ. Аминокислотные радикалы в активном центре могут находиться в любом сочетании, при этом рядом располагаются аминокислоты, значительно удаленные друг от друга в линейной цепи. В активном центре выделяют два участка:

• якорный (контактный, связывающий) – отвечает за связывание и ориентацию субстрата в активном центре,
• каталитический – непосредственно отвечает за осуществление реакции.

Схема строения ферментов

У ферментов, имеющих в своем составе несколько мономеров, может быть несколько активных центров по числу субъединиц. Также две и более субъединицы могут формировать один активный центр.

У сложных ферментов в активном центре обязательно расположены функциональные группы кофактора.

Схема формирования сложного фермента

2. Аллостерический центр (allos – чужой) – центр регуляции активности фермента, который пространственно отделен от активного центра и имеется не у всех ферментов. Связывание с аллостерическим центром какой-либо молекулы (называемой активатором или ингибитором, а также эффектором, модулятором, регулятором) вызывает изменение конфигурации белка-фермента и, как следствие, скорости ферментативной реакции.

Аллостерические ферменты являются полимерными белками, активный и регуляторный центры находятся в разных субъединицах.

Схема строения аллостерического фермента

В качестве такого регулятора может выступать продукт данной или одной из последующих реакций, субстрат реакции или иное вещество (см "Регуляция активности ферментов ").

Изоферменты

Изоферменты – это молекулярные формы одного и того же фермента, возникшие в результате небольших генетических различий в первичной структуре фермента, но катализирующие одну и ту же реакцию . Изоферменты отличаются сродством к субстрату, максимальной скоростью катализируемой реакции, чувствительностью к ингибиторам и активаторам, условиями работы (оптимум pH и температуры).

Как правило, изоферменты имеют четвертичную структуру, т.е. состоят из двух или более субъединиц. Например, димерный фермент креатинкиназа (КК) представлен тремя изоферментными формами, составленными из двух типов субъединиц: M (англ. muscle – мышца) и B (англ. brain – мозг). Креатинкиназа-1 (КК-1) состоит из субъединиц типа B и локализуется в головном мозге, креатинкиназа-2 (КК-2) – по одной М- и В-субъединице, активна в миокарде, креатинкиназа-3 (КК-3) содержит две М-субъединицы, специфична для скелетной мышцы.

Также существует пять изоферментов лактатдегидрогеназы (роль ЛДГ) – фермента, участвующего в обмене глюкозы. Отличия между ними заключаются в разном соотношении субъединиц Н (англ. heart – сердце) и М (англ. muscle – мышца). Лактатдегидрогеназы типов 1 (Н 4) и 2 (H 3 M 1) присутствуют в тканях с аэробным обменом (миокард, мозг, корковый слой почек), обладают высоким сродством к молочной кислоте (лактату) и превращают его в пируват. ЛДГ-4 (H 1 M 3) и ЛДГ-5 (М 4) находятся в тканях, склонных к анаэробному обмену (печень, скелетные мышцы, кожа, мозговой слой почек), обладают низким сродством к лактату и катализируют превращение пирувата в лактат. В тканях с промежуточным типом обмена (селезенка, поджелудочная железа, надпочечники, лимфатические узлы) преобладает ЛДГ-3 (H 2 M 2).

Еще одним примером изоферментов является группа гексокиназ , которые присоединяют фосфатную группу к моносахаридам гексозам и вовлекают их в реакции клеточного метаболизма. Из четырех изоферментов выделяется гексокиназа IV (глюкокиназа ), которая отличается от остальных изоферментов высокой специфичностью к глюкозе, низким сродством к ней и нечувствительностью к ингибированию продуктом реакции.

Мультиферментные комплексы

В мультиферментном комплексе несколько ферментов прочно связаны между собой в единый комплекс и осуществляют ряд последовательных реакций, в которых продукт реакции непосредственно передается на следующий фермент и является только его субстратом. Возникает туннельный эффект , т.е. субстрат попадает в созданный ферментами "туннель". В результате промежуточные метаболиты избегают контакта с окружающей средой, снижается время их перехода к следующему активному центру и значительно ускоряется скорость реакции.

) и катализирующие конкретные реакции. Такая способность возникает в результате формирования промежуточного продукта при связывании антитела с антигеном (имитация переходного комплекса E-X ферментативной реакции).

Активный центр фермента - это участок, который связывает субстраты (и простетическую группу, если она есть) и в котором содержатся аминокислотные остатки, непосредственно участвующие в образовании или разрыве химических связей. Такие остатки называют каталитическими группами. Несмотря на огромное разнообразие структуры ферментов, их специфичности и механизма каталитического действия, все же можно сделать ряд обобщений в отношении свойств активных центров.

1. На активный центр приходится относительно малая часть общего объема фермента. Большая часть аминокислотных остатков в молекуле фермента не контактирует с субстратом. Остается загадкой,

Рис. 6.9. Скорость ферментативной реакции как функция концентрации субстрата.

Рис. 6.10. Взаимодействие субстратов с ферментами согласно модели ключ-замок. Активный центр фермента сам по себе комплементарен по форме субстрату.

почему размер ферментов так велик. Почти все ферменты содержат более 100 аминокислотных остатков и имеют массу свыше 10 к Да, а диаметр - свыше 25 А.

2. Активный центр - трехмерное образование. Другими словами, это не точка, не линия и даже не плоскость, а сложная трехмерная структура, в формировании которой участвуют группы, принадлежащие разным частям линейной последовательности аминокислот. Действительно, как мы уже видели на примере гемоглобина и миоглобина, взаимодействие между аминокислотными остатками, расположенными далеко друг от друга в линейной последовательности, нередко сильнее, чем взаимодействие между соседними (в последовательности) остатками аминокислот. В лизоциме - ферменте, который мы рассмотрим подробно в следующей главе, основные группы активного центра представлены аминокислотными остатками, занимающими 35, 52, 62, 63 и 101-е положения в линейной последовательности из 129 аминокислот.

3. Субстраты относительно слабо связываются с ферментами. Константы равновесия -комплексов обычно лежат в пределах от до что соответствует свободным энергиям взаимодействия от - 3 до - 12 ккал/моль. Сравним эти величины с силой ковалентных связей, составляющей от - 50 до - 110 ккал/моль.

4. Активный центр имеет форму узкого углубления или щели. Во всех ферментах с изученной структурой связывание субстратов происходит в таком углублении или щели, куда нет доступа воде, за исключением тех случаев, когда вода является одним из реагирующих веществ. В этом углублении присутствует несколько полярных аминокислотных остатков, необходимых для связывания и катализа. Неполярный характер всей области в целом способствует связыванию субстрата. Кроме того, щелевидная форма активного центра создает микроокружение, в котором отдельные полярные остатки приобретают особые свойства, существенно важные для катализа.

5. Специфичность связывания зависит от строго определенного расположения атомов в активном центре. Субстрат входит в активный центр, только если он соответствует ему по форме. В 1890 г. Эмиль Фишер (Е. Fischer) использовал сравнение с ключом и замком (рис. 6.10), которое оказалось по существу правильным и исключительно плодотворным представлением о стереоспецифичности катализа. Однако, как показывают работы последних лет, активные центры некоторых ферментов не являются жесткой структурой, их форма модифицируется при связывании субстратов. В этих ферментах форма активного центра становится комплементарной форме субстрата

Рис. 6.11. Взаимодействие субстратов с ферментами согласно модели индуцированного соответстия. При связывании субстрата происходит изменение формы фермента. Активный центр фермента только после присоединения субстрата становится комплементарным ему по форме.

Рис. 6.12. График зависимости скорости реакции V от концентрации субстрата для фермента, подчиняющегося кинетике Михаэлиса - Ментен (Ктах-максимальная скорость, - константа Михаэлиса).

только после связывания субстрата. Такой процесс динамического узнавания называют индукцией соответствия (рис. 6.11). Кроме того, некоторые ферменты предпочтительно связывают субстрат в напряженной («искаженной») форме, соответствующей переходному состоянию.

Любая ферментативная реакция начинается с взаимодействия субстрата, в большинстве случаев, небольшой по размерам молекулы, с активным центром фермента. Под активным центром фермента понимают совокупность аминокислотных остатков, осуществляющих связывание (сорбцию) субстрата, его химическую активацию и превращение. Активный центр белковой молекулы фермента имеет сложную конфигурацию; он включает как полярные (гидрофильные), так и неполярные (гидрофобные) группы.

Структура активного центра фермента складывается из двух составляющих:

1) сорбционного участка (подцентра, сайта), ответственного за связывание, фиксацию и ориентацию субстратов; свойства этого центра определяют специфичность действия фермента;

2) каталитического участка (подцентра, сайта), осуществляющего химическое превращение молекул субстрата и использующего для этих целей, как правило, общий кислотно-основной катализ.

Аминокислотные остатки, образующие каталитический центр однокомпонентного фермента, расположены в различных точках единой полипептидной цепи. Поэтому активный центр, представляющий собой уникальное сочетание нескольких аминокислотных остатков, возникает в тот момент, когда белковая молекула приобретает присущую ей третичную структуру. Чаще всего в активных центрах однокомпонентных ферментов встречаются остатки Ser , His , три, Arg , Cys , Asp , Glu и Tyr . Изменение третичной структуры фермента под влиянием тех или иных факторов может привести к деформации активного центра и изменению ферментативной активности.

Активный центр двухкомпонентных ферментов представлен небелковым компонентом – коферментом (простетической группой) и несколькими выше приведенными минокислотными остатками.

Характерной особенностью cложных или двухкомпонентных ферментов является то, что ни белковая часть, ни добавочная группа в отдельности не обладают заметной каталитической активностью. Только их комплекс проявляет ферментативные свойства. При этом белок резко повышает каталитическую активность добавочной группы, присущую ей в свободном состоянии в очень малой степени; добавочная же группа стабилизирует белковую часть и делает ее менее уязвимой к денатурирующим агентам. Таким образом, хотя непосредственным исполнителем каталитической функции является простетическая группа, образующая каталитический центр, ее действие немыслимо без участия полипептидных фрагментов белковой части фермента.

В апоферменте есть участок, характеризующийся специфической структурой, избирательно связывающий кофермент. Это так называемый кофермент связывающий домен ; его структура у различных апоферментов, соединяющихся с одним и тем же коферментом, очень сходна. Таковы, например, пространственные структуры нуклеотидсвязывающих доменов ряда дегидрогеназ (рис. 1.5.1).

Рис. 1.5.1. Активный центр глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

Методы изучения активных центров ферментов

Представление об активном центре сформировалось в результате анализа данных по ингибированию реакций и химической модификации белковой молекулы. Необратимые ингибиторы блокируют каталитическую активность фермента, осуществляя химическую модификацию одной из групп, участвующих в каталитическом превращении субстрата. Обратимые ингибиторы, образуя комплекс с функциональной группой белка, вызывают либо существенное изменение свойств данной группы (неконкурентные ингибиторы), либо конкурентно блокируют сорбцию (комплексообразование) субстрата в области каталитического центра.

Рассмотрим некоторые примеры.

Сериновые протеазы и эстеразы. Каталитически активной группой многих ферментов является гидроксильная группа серина. В активном центре эта спиртовая группа играет роль нуклеофильного реагента в реакциях нуклеофильного замещения при гидролизе сложных эфиров, амидов, пептидов. Представителем семейства сериновых протеаз является простагландин-Н-синтаза, участвующая в метаболизме арахидоновой кислоты.

Простагландин-Н-синтаза. Аспирин (ацетилсалициловая кислота) представляет собой нестероидный противовоспалительный лекарственный препарат. Физиологическое действие препарата связано с его способностью ацетилировать Ser-514, входящий в центр сорбции арахидоновой кислоты - субстрата ПНС.

Рис. 1.5.2. Блокирование гидроксильной группы серина в активном центре простагландин-Н-синтазы

Аспирин выступает необратимым ингибитором лимитирующего фермента синтеза простагландинов. Последующий гидролиз модифицированного белка и анализ продуктов гидролиза позволили идентифицировать центр модификации фермента.

Несмотря на то, что метод химической модификации позволяет получить весьма важную информацию о природе активных центров ферментов, он имеет и определенные недостатки.

Функциональные группы белка, составляющие активный центр, могут быть замаскированы полипептидной цепью или остатками других аминокислот, что делает группы активного центра недоступными для реагента-модификатора. Химическая модификация, как правило, не является избирательной, химической реакции подвергаются сразу несколько аминокислотных остатков в белке. Это ведет к существенному изменению структуры белка, развитию инактивационных и денатурационных процессов, что может привести к потере ферментом каталитической активности даже в том случае, если химически модифицировались остатки, не входящие в каталитический центр. Выводы об участии тех или иных функциональных групп аминокислот в каталитическом процессе на основе данных по химической модификации белка могут быть сделаны с известной осторожностью и оговорками.

Таким образом, метод химической модификации не позволяет получить исчерпывающую информацию об участниках каталитического акта.

Как правило, для такого рода выводов требуются независимые структурные исследования.

Ситуация становится более однозначной, если химический модификатор встраивается в структуру специфического субстрата или ингибитора фермента. В этом случае модификатор адресно направляется в активный центр, что существенно увеличивает вероятность химической реакции с функциональной группой активного центра.

Новые возможности идентификации групп, входящих в активные центры ферментов, появились с развитием техники сайт-специфического мутагенеза. Для ферментов, экспрессию генов которых можно организовать с помощью генно-инженерных конструкций типа плазмид, оказалась возможной замена отдельных аминокислот на уровне ДНК с последующей экспрессией и изучением каталитических свойств получаемых белков. Это позволяет получить важную информацию об участии той или иной аминокислоты данного фрагмента полипептидной цепи в каталитическом акте. Однако и в этом случае при интерпретации результатов необходима известная осторожность, поскольку в белках имеется большое число аминокислот, формирующих структуру активного центра, но не принимающих непосредственное участие в акте катализа.

Окончательная информация о структуре активного центра активного центра может быть получена методом рентгеноструктурного анализа (РСА) и спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения. В первом случае исследование проводят на кристаллах фермента, во втором ‒ исследуют растворы фермента. Для идентификации групп, принимающих участие в катализе, обычно используют образование комплекса ферментов с ингибиторами или мало реакционноспособными аналогами субстратов (т.н. квазисубстратами).

Метод РСА впервые был использован Липскомбом с сотрудниками при анализе активного центра карбоксипептидазы А. На рис. 1.5.3. показана структура карбоангидразы по данным рентгеноструктурного анализа.

Рис. 1.5.3. Третичная структура карбоангидразы по данным рентгеноструктурного анализа: а) общий вид ферментной глобулы; б) пространственное расположение аминокислотных остатков

Структуру и свойства каждого белка определяет последовательность аминокислот. В настоящее время становится очевидным, что при большой вариабельности белков некоторые элементы структуры являются консервативными, и эти элементы в значительной степени определяют функцию белковой молекулы. Это особенно характерно для белков, выполняющих каталитическую функцию. Например, для гидролаз, составляющих около трети всех известных ферментов (приблизительно 1100 из 3700), типов структур каталитических центров всего четыре.

Чтобы ответить на вопросы, какие химические структуры образуют каталитический центр, каким образом аминокислоты, расположенные на разных, зачастую удаленных друг от друга участках полипептидной цепи, находят друг друга и формируют уникальную структуру, ‒ используют методы биоинформатики.

По мнению энзимологов в рамках одного суперсемейства ферментов сорбционный сайт, отвечающий за специфичность, может быть представлен многими вариантами аминокислотных остатков, соответствующими вариантам структуры субстратов. В то же время каталитические сайты, число типов которых весьма ограничено, являются консервативными (незаменимыми) элементами структуры. Для подтверждения этого положения был использован биоинформационный подход, основанный на сравнении последовательностей аминокислот в белках, объединенных в одно крупное семейство.

Был проведен анализ нескольких больших семейств ферментов, представленных в базе данных HSSP (www.sander.embl-heidelberg.de/ ). Выбор семейств ферментов был сделан на основании следующих критериев:

1) число анализируемых представителей семейства должно быть более 100; это необходимо для обеспечения статистической достоверности результатов;

2) для анализа следует выбирать семейства ферментов различных классов (оксидоредуктазы, гидролазы, изомеразы и т.д.);

3) по возможности следует выбирать ферменты, для которых установлена структура активных центров и с высокой степенью достоверности изучен механизм катализа.

Проведенный анализ показал, что в полипептидной цепи большая часть позиций аминокислот высоко вариабельна, это означает, что функционирование фермента не зависит от того, какую позицию занимает та или иная аминокислота. В то же время имеются позиции аминокислот, которых относительно немного. Эти позиции и соответствующие им аминокислоты называют консервативными. Именно они играют особую роль в функционировании фермента. Что же это за аминокислоты, и какова их роль?

Биоинформационный анализ ферментов всех классов показал, что наиболее часто консервативной аминокислотой является глицин. По рейтингу консервативности аминокислоты располагаются в следующем ряду: глицин > аспарагиновая кислота > цистеин > пролин > гистидин > аргинин > глутаминовая кислота. Это наиболее важные аминокислоты в ферментативном катализе. В сумме глицин и аспарагиновая кислота составляют примерно 50% всех консервативных аминокислот. Из наиболее часто встречающихся консервативных элементов структуры ферментов можно отметить глицин, аспарагиновую кислоту, цистеин, пролин и гистидин. Эти аминокислоты составляют примерно 70% всех консервативных элементов. Метионин и изолейцин практически никогда не бывают консервативными.

В свою очередь наиболее консервативные аминокислоты можно разделить на две принципиально разные группы:

1) аминокислоты, участвующие в активации молекул субстрата в качестве кислот и оснований (аспарагиновая кислота и гистидин);

2) аминокислоты, формирующие геометрию активного центра (глицин, цистеин, пролин).

Таким образом, статистический анализ показал, что каталитическую функцию фермента и архитектуру активного центра формирует небольшая, но определенная часть аминокислот, занимающих строго фиксированные позиции в полипептидной цепи. Консервативные аминокислоты являются либо кислотами или основаниями (электрофильные и нуклеофильные агенты), формирующими каталитический сайт, либо важными структурообразующими аминокислотами, формирующими структуру белка в целом.

Каталитическую функцию выполняют аспарагиновая кислота, гистидин, аргинин, и глутаминовая кислота. Структурообразующими аминокислотами являются глицин, цистеин, и пролин. Глицин и пролин, обеспечивающие возможность поворота цепи, необходимы для того, чтобы активный центр был образован аминокислотами, расположенными на разных участках полипептидной цепи. А цистеин необходим для фиксации необходимой конформации полипептидной цепи.

Природа сформировала активные центры ферментов из ограниченного числа компонентов. Большая часть активных центров ферментов всех классов сформирована из аспарагиновой и глутаминовой кислот, из гистидина и аргинина, из ионов нескольких металлов. Как следствие, число типов каталитических центров невелико. Например, для гидролаз, составляющих около трети всех известных ферментов, можно идентифицировать всего четыре основных типа структуры. Эффективные комбинации каталитических групп, характерные для одних реакций, природа активно использует для организации каталитических центров других типов реакций.

Полипептидная цепь обеспечивает организацию каталитических групп в активные центры. Как известно, в растворе практически исключены трехмолекулярные реакции и реакции более высоких порядков. В ферментативных процессах в реакции участвуют четыре (или пять) остатков различных аминокислот, организованных в полипептидную цепь. Ферментативный катализ не использует сильных химических агентов; компоненты, составляющие активные центры, ‒ это относительно слабые кислоты и основания. Однако они хорошо организованы в пространстве и, как следствие, весьма эффективны.

Примеры активных центров некоторых ферментов

Остановимся на ферментах класса гидролаз, для большинства которых идентифицированы группы, составляющие каталитически активные центры, и созданы обоснованные представления о взаимодействии этих групп в механизме каталитического цикла.

По структуре активных центров и механизму действия гидролазы условно можно разделить на 4 основных типа.

1. Гидролазы, содержащие в активном центре аспарагиновую или глутаминовую кислоту (лизоцим-пепсиновый тип).

2. Гидролазы, содержащие в активном центре гидроксильную группу серина, треонина или цистеина и цепь переноса протонов, активирующую эту группу (тип химотрипсина); гидролазы, использующие имидазольную группу гистидина непосредственно для активации воды (тип панкреатической рибонуклеазы).

3. Гидролазы, использующие комплексы Zn 2+ или Со 2+ для активации воды и субстрата (тип щелочной фосфатазы, карбоксипептидазы А).

4. Гидролазы, использующие ионы Мg 2+ или Мn 2+ для активации воды и субстрата (тип пирофосфатазы).

Химотрипсин. В активный центр входят Ser-195, His-57, Asp-102.

Рис. 1.5.4. Структура химотрипсина

Лактатдегидрогеназа. Это NAD + -зависимая дегидрогеназа. Осуществляет обратимое окисление-восстановление органических молекул, при этом в качестве донора (акцептора) гидрид-иона выступает кофермент. Каталитически активные группы фермента представлены Arg-165, His-194, Arg-105. Все эти аминокислоты являются консервативными. Молочная или пировиноградная кислоты фиксируются в активном центре с помощью положительного заряда Arg-168. Участниками каталитического процесса являются протон-транспортная цепь His-194-Asp-165 и Arg-105.

Рис. 1.5.5. Структура лактатдегидрогеназы

(а) Схематическое изображение тетрамера и (b) - отдельной субъединицы; (с) Модель NAD + -связывающего региона. Никотинамидное кольцо NAD + связывается между цепями d и е, а адениновое кольцо – между а и b.

На рис. 1.5.6. приведены возможные типы связей, участвующих в присоединении NAD + в активном центре ЛДГ.

Рис. 1.5.6. Связывание NAD + лактатдегидрогеназой

Линии, показанные точками – водородные связи, перекрестные линии – электростатические взаимодействия, аминокислотные остатки в рамках – гидрофобные взаимодействия

Триозофосфатизомераза. Каталитически важные группировки активного центра фермента представлены Glu-165 и His-95.

Рис. 1.5.7. Структура субъединицы триозофосфатизомеразы дрожжей

Глицин, цистеин и пролин как структурообразующие аминокислоты

Глицин в силу особенностей его строения не участвует в химических актах активации молекул в каталитическом цикле. Не обладая заместителем у α-углеродного атома, глицин лишен выраженной химической функции. Тем не менее наличие глицина в структуре белка очень важно. Так, сайт-специфическая замена глицина в консервативных позициях на любую из аминокислот приводит, как правило, к полной потере (или существенному снижению) активности фермента.

По-видимому, глицин в консервативных позициях важен по следующим причинам.

1. Являясь уникальной аминокислотой с наиболее энергетически облегченным вращением вокруг связей С-N и С-С полипептидной цепи, глицин может играть роль узловой точки, обеспечивающей возможность изменения направления полипептидной цепи при «сборке» аминокислотных остатков в активный центр. Таким образом, наличие консервативных глицинов позволяет объяснить структурный парадокс ферментативного катализа, когда одинаковые активные центры «собираются» из абсолютно разных полипептидных цепей. Общим для этих цепей являются наличие глицина в консервативных позициях и возможность стабилизации собранной структуры, например, за счет дисульфидных связей (цистеин также проявляет высокую степень консервативности, занимая третью позицию в рейтинге консервативности).

2. Глицин в консервативных позициях может играть роль конформационных «шарниров», обеспечивая возможность «сборки» активного центра и известную конформационную подвижность. Подтверждением этому служит то, что во многих случаях вблизи каталитически активных групп можно обнаружить глицин в консервативных позициях. Например, для гидролаз различных семейств консервативными являются следующие мотивы: Asp-215-X-Gly-217 (пепсин); Asp-170-Xаа-Xаа-Gly-173 (термолизнн); Gly-173-Xаа-Ser-177 (трипсин); His-76-Gly-77, Ser-153-Xаа-Gly-155, Gly-175-Xаа-Asp-177 (липазы). Здесь Хаа ‒ произвольная аминокислота. Аминокислоты Asp, His, Ser в указанных ферментах входят в структуру активных центров.

Превращение исходного субстрата в конечные продукты в ферментативном катализе сопряжено с участием большого числа интермедиатов с отличной от исходного субстрата структурой. Глицины активного центра могут играть роль «релаксирующих» элементов, конформационно подстраивая активный центр для следующего элементарного акта.

Существенную роль в формировании архитектуры активного центра играют цистеин и пролин (соответственно 3-я и 4-я позиции в рейтинге консервативных аминокислот). Пролин, как известно, является уникальной аминокислотой, разворачивающей полипептидную цепь. Роль цистеина заключается в том, что необходимая конформация активного центра, складывающаяся из различных участков полипептидной цепи, фиксируется химической связью в виде дисульфидного мостика. Для многих ферментов это завершает формирование архитектуры активного центра.

Таким образом, активный центр состоит из ряда функциональных групп, определенным образом ориентированных в пространстве. Среди них различают группы, входящие в состав каталитического сайта активного центра, и группы, образующие сайт, обеспечивающий специфическое сродство, т.е. связывание субстрата ферментом – так называемый контактный или «якорный» участок. Это деление достаточно условно, поскольку взаимодействия в контактном участке фермента при образовании фермент-субстратного комплекса, оказывает существенное влияние на скорость и направление превращений в каталитическом участке.

8.7.1. В клеточном содержимом ферменты распределены не хаотически, а строго упорядоченно. При помощи внутриклеточных мембран клетка разделена на отсеки или компартменты (рисунок 8.18). В каждом из них осуществляются строго определенные биохимические процессы и сосредоточены соответствующие ферменты или полиферментные комплексы. Вот несколько характерных примеров.

Рисунок 8.18. Внутриклеточное распределение ферментов различных метаболических путей.

В лизосомах сосредоточены преимущественно разнообразные гидролитические ферменты. Здесь протекают процессы расщепления сложных органических соединений на их структурные компоненты.

В митохондриях находятся сложные системы окислительно-восстановительных ферментов.

Ферменты активирования аминокислот распределены в гиалоплазме, но они же есть и в ядре. В гиалоплазме присутствуют многочисленные метаболоны гликолиза, структурно объединенные с таковыми пентозофосфатного цикла, что обеспечивает взаимосвязь дихотомического и апотомического путей распада углеводов.

В то же время ферменты, ускоряющие перенос аминокислотных остатков на растущий конец полипептидной цепи и катализирующие некоторые другие реакции в процессе биосинтеза белка, сосредоточены в рибосомальном аппарате клетки.

В клеточном ядре локализованы в основном нуклеотидилтрансферазы, ускоряющие реакцию переноса нуклеотидных остатков при новообразовании нуклеиновых кислот.

8.7.2. Распределение ферментов по субклеточным органеллам изучают после предварительного фракционирования клеточных гомогенатов путем высокоскоростного центрифугирования, определяя содержание ферментов в каждой фракции.

Локализацию данного фермента в ткани или клетке часто удается установить in situ гистохимическими методами («гистоэнзимология»). Для этого тонкие (от 2 до 10 мкм) срезы замороженной ткани обрабатывают раствором субстрата, к которому специфичен данный фермент. В тех местах, где находится фермент, образуется продукт катализируемой этим ферментом реакции. Если продукт окрашен и нерастворим, он остается на месте образования и позволяет локализовать фермент. Гистоэнзимология дает наглядную и в известной мере физиологичную картину распределения ферментов.

Ферментные системы ферментов, сосредоточенные во внутриклеточных структурах, тонко координированы друг с другом. Взаимосвязь катализируемых ими реакций обеспечивает жизнедеятельность клеток, органов, тканей и организма в целом.

При исследовании активности различных ферментов в тканях здорового организма можно получить картину их распространения. Оказывается, что некоторые ферменты широко распространены во многих тканях, но в разных концентрациях, а другие очень активны в экстрактах, полученных из одной или нескольких тканей, и практически отсутствуют в остальных тканях организма.

Рисунок 8.19. Относительная активность некоторых ферментов в тканях человека, выраженная в процентах от активности в ткани с максимальной концентрацией данного фермента (Мосс, Баттерворт, 1978).

8.7.3. Понятие об энзимопатиях. В 1908 году английский врач Арчибальд Гаррод высказал предположение, что причиной ряда заболеваний может являться отсутствие какого-либо из ключевых ферментов, участвующих в обмене веществ. Он ввёл понятие "inborn errors of metabolism" (врождённый дефект обмена веществ). В дальнейшем эта теория была подтверждена новыми данными, полученными в области молекулярной биологии и патологической биохимии.

Информация о последовательности аминокислот в полипептидной цепи белка записана в соответствующем участке молекулы ДНК в виде последовательности тринуклеотидных фрагментов - триплетов или кодонов. Каждый триплет кодирует определённую аминокислоту. Такое соответствие называется генетическим кодом. Причём некоторые аминокислоты могут быть закодированы при помощи нескольких кодонов. Существуют также специальные кодоны, являющиеся сигналами для начала синтеза полипептидной цепи и его прекращения. К настоящему времени генетический код полностью расшифрован. Он является универсальным для всех видов живых организмов.

Реализация информации, заложенной в молекуле ДНК, включает несколько этапов. Сначала в клеточном ядре в процессе транскрипции синтезируется матричная РНК (мРНК), поступающая в цитоплазму. В свою очередь, мРНК служит матрицей для трансляции - синтеза полипептидных цепей на рибосомах. Таким образом, природа молекулярных болезней определяется нарушением структуры и функции нуклеиновых кислот и контролируемых ими белков.

8.7.4. Поскольку информация о структуре всех белков клетки содержится в последовательности нуклеотидов ДНК, а каждая аминокислота определяется триплетом нуклеотидов, изменение первичной структуры ДНК может в конечном счёте оказать глубокое влияние на синтезируемый белок. Подобные изменения происходят за счёт ошибок репликации ДНК, когда одно азотистое основание заменяется другим, либо в результате действия радиации или при химической модификации. Все возникшие таким образом наследуемые дефекты называются мутациями . Они могут приводить к неправильному считыванию кода и делеции (выпадению) ключевой аминокислоты, замене одной аминокислоты другой, преждевременной остановке белкового синтеза или добавлению аминокислотных последовательностей. Учитывая зависимость пространственной упаковки белка от линейной последовательности в нём аминокислот, можно полагать, что подобные дефекты способны изменить структуру белка, а значит, и его функцию. Тем не менее, многие мутации обнаруживаются только в лабораторных условиях и не оказывают вредного воздействия на функции белка. Таким образом, ключевым моментом является локализация изменений в первичной структуре. Если положение замененной аминокислоты окажется критическим для формирования третичной структуры и образования каталитического центра фермента, то мутация является серьёзной и может проявиться как заболевание.

Последствия недостаточности одного фермента в цепи реакций обмена веществ могут проявляться по-разному. Предположим, что превращение соединения A в соединение B катализирует фермент Е и что соединение C встречается на альтернативном пути превращений (рисунок 8.20):

Рисунок 8.20. Схема альтернативных путей биохимических превращений.

Последствиями недостаточности фермента могут быть следующие явления:

1. недостаточность продукта ферментативной реакции (B ). В качестве примера можно указать на снижение содержания глюкозы в крови при некоторых формах гликогенозов;
2. накопление вещества (A ), превращение которого катализирует фермент (например, гомогентизиновая кислота при алкаптонурии). При многих лизосомных болезнях накопления, вещества, в норме подвергающиеся гидролизу в лизосомах, накапливаются в них в связи с недостаточностью одного из ферментов;
3. отклонение на альтернативный путь с образованием некоторых биологически активных соединений (C ). К этой группе явлений относится экскреция с мочой фенилпировиноградной и фенилмолочной кислот, образующихся в организме больных фенилкетонурией в результате активации вспомогательных путей распада фенилаланина.

Если метаболическое превращение в целом регулируется по принципу обратной связи конечным продуктом, то эффекты двух последних типов аномалий будут более значительными. Так, например, при порфириях (врождённых нарушениях синтеза гема) устраняется подавляющего эффекта гема на начальные реакции синтеза, что приводит к образованию избыточных количеств промежуточных продуктов метаболического пути, которые обладают токсическим действием на клетки кожи и нервной системы.

Факторы внешней среды могут усиливать или даже полностью определять клинические проявления некоторых врождённых нарушений обмена веществ. Например, у многих пациентов с недостаточностью глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы заболевание начинается только после приёма таких лекарственных средств, как примахин. В отсутствие контактов с лекарственными средствами такие люди производят впечатление здоровых.

8.7.5. О недостаточности фермента обычно судят косвенно по повышению концентрации исходного вещества, которое в норме подвергается превращениям под действием данного фермента (например, фенилаланин при фенилкетонурии). Прямое определение активности таких ферментов проводят только в специализированных центрах, но по возможности диагноз следует подтверждать этим методом. Пренатальная (дородовая) диагностика некоторых врождённых нарушений метаболизма возможна путём иследования клеток амниотической жидкости, полученных на ранних стадиях беременности и культивируемых in vitro.

Некоторые врождённые нарушения метаболизма поддаются лечению путём доставки в организм недостающего метаболита или путём ограничения поступления в желудочно-кишечный тракт предшественников нарушенных процессов обмена веществ. Иногда могут быть удалены накапливающиеся продукты (например, железо при гемохроматозе).

Ферменты – высокомолекулярные вещества, молекулярный вес которых достигает нескольких млн. Молекулы субстратов, взаимодействующих с ферментами обычно имеют гораздо меньший размер. Поэтому естественно предположить, что с субстратом взаимодействует не вся молекула фермента в целом, а только какая-то ее часть – так называемый “активный центр” фермента.

Активный центр фермента – это часть его молекулы, непосредственно взаимодействующая с субстратами участвующая в акте катализа.

Активный центр фермента формируется на уровне третичной структуры. Поэтому при денатурации, когда третичная структура нарушается, фермент теряет свою каталитическую активность !

Активный центр в свою очередь состоит из:

- каталитического центра, который осуществляет химическое превращение субстрата;

- субстратного центра (“якорной” или контактной площадки), которая обеспечивает присоединение субстрата к ферменту, формирование фермент-субстратного комплекса.

Четкую грань между каталитическим и субстратным центром провести можно не всегда – у некоторых ферментов они совпадают или перекрываются.

Помимо активного центра, в молекуле фермента существует т.н. аллостерический центр . Это участок молекулы фермента, в результате присоединения к которому определенного низкомолекулярного вещества (эффектора ), изменяется третичная структура фермента. Это приводит к изменению конфигурации активного центра и, следовательно, к изменению активности фермента. Это явление аллостерической регуляции активности фермента.

Многие ферменты являются мультимерами (или олигомерами ), т.е. состоят из двух и более субъединиц- протомеров (аналогично четвертичной структуре белка).

Связи между субъединицами, в основном, не ковалентные. Максимальную каталитическую активность фермент проявляет именно в виде мультимера. Диссоциация на протомеры резко снижает активность фермента.

Ферменты – мультимеры содержат обычно четкое число субъединиц (2-4), т.е. являются ди- и тетрамерами. Хотя известны гекса- и октамеры (6-8) и чрезвычайно редко встречаются тримеры и пентамеры (3-5).

Ферменты-мультимеры могут быть построены как из одинаковых, так и из разных субъединиц.

Если ферменты-мультимеры образованы из субъединиц различных типов, они могут существовать в виде нескольких изомеров. Множественные формы фермента называют изоферментами (изоэнзимами или изозимами).

Например, фермент состоит из 4 субъединиц типов А и Б. Он может образовать 5 изомеров: АААА, АААБ, ААББ, АБББ, ББББ. Эти изомерные ферменты являются изоферментами.

Изоферменты катализируют одну и ту же химическую реакцию, обычно воздействуют на один и тот же субстрат, но отличаются по некоторым физико-химическим свойствам (молекулярной массе, аминокислотному составу, электрофоретической подвижности и др.), по локализации в органах и тканях.

Особую группу ферментов составляют т.н. мультимерные комплексы. Это системы ферментов, катализирующих последовательные стадии превращения какого-либо субстрат. Такие системы характеризуются прочностью связи и строгой пространственной организацией ферментов, обеспечивающей минимальный путь прохождения субстрата и максимальную скорость его превращения.

Примером может служить мультиферментный комплекс, осуществляющий окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты. Комплекс состоит из 3-х видов ферментов (М.в. = 4 500 000).