Дифференциально- диагностические среды. Медицинская энциклопедия - дифференциально-диагностические среды Дифференциальные среды

1. ПС для культивирования и изучения биохимических свойств.

1.1. Среды Эндо, Левина, Плоскирева . Используют как дифференциально-диагностические элективные среды для культивирования бактерий кишечной группы (содержит лактозу). Микроорганизмы, ферментирующие находящийся в этих средах молочный сахар (лактозу) образуют окрашенные колонии- лактозоположительные (колонии красного цвета с металлическим блеском или без блеска) . Колонии микробов, не ферментирующие лактозу, бесцветные - лактозонегативные – нежно-розовые, прозрачные, пропускающие свет.

К 100 мл МПА (рН 7,6) при температуре 70°С стерильно добавляют 5 мл 20% раствора лактозы и смесь 0,5 мл насыщенного раствора основного фуксина с 1,25 мл свежеприготовленного раствора сульфата натрия.

1.2.Среды с крахмалом определяют микроорганизмы, образующие амилазу. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель раствора Люголя, - цвет среды не изменяется. Нерасщепленный крахмал дает с этим раствором синее окрашивание.

1.3.Молоко. При росте микроорганизмов, сбраживающих лактозу, свертывается.

2. Коммерческие наборы – для изучения биохимических свойств (определение набора ферментов микроорганизмов для их идентификации).

2.1. Микротесты - системы (МТС). Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых содержатся стерильные дифференциально-диагностические среды.

2.2.Системы индикаторные бумажные (СИБ) - дифференциально-диагностические среды на фильтровальной бумаге.

3. Для культивирования и дифференциации анаэробных микроорганизмов: среда Вильсон-Блера . Готовят из мясо-пептонного агара, к которому добавляют глюкозу, Na 2 S0 3 , хлорид железо FeCl 2 . На этой среде возбудитель газовой гангрены образует почернение и разрыв агара. Рост происходит в глубине агара. При этом осуществляется восстановление Na 2 S0 3 в Na 2 S (сульфит натрия), который соединяясь с хлоридом железа, образует сульфат железа черного цвета. Разрыв питательной среды связан с газообразованием.

4. ПС для изучения сахаролитических свойств:

Среды Гисса с углеводами (глюкоза, лактоза, сахароза, арабиноза и другие) в которых выявляют ферментативную активности микроорганизмов. Под действием образующейся при расщеплении углевода кислоты индикатор изменяет окраску среды. Соломенно-желтого цвета среда при положительной реакции меняет цвет на красный или интенсивно розовый, поэтому эти среды названы «пестрый ряд». Микробы, не ферментирующие данный углевод, растут на среде, не изменяя ее цвета. Наличие газа устанавливают по образованию пузырьков в средах с агаром или по скоплению его в «поплавке» на жидких средах.

Пептон - 10 г, хлорид натрия - 5 г, углевод - 10 г, реактив Андреде (фуксин)- 10 мл, вода дистиллированная до 1000 мл, рН после стерилизации 7,2-7,4.

5. ПС для изучения протеолитических свойств:

Среды с желатином . В некоторых бактериях (холерный вибрион, стафилококк, сибиреязвенная палочка и т. д.) протеолитические ферменты выявля­ются путем разжижения желатины.

Среды с молоком. Микроорганизмы, расщепляющие казеин (молочный белок), вызывают пептонизацию молока - оно приобретает вид молочной сыворотки.

Среды с пептоном. При расщеплении пептонов могут выделяться индол, сероводород, аммиак. Их образования определяют с помощью индикаторных бумажек. Фильтровальную бумагу заранее пропитывают определенными растворами, высушивают, нарезают полосками и, после посева культуры на МПБ, помещают под пробку между нею и стенкой пробирки. После инкубации в термостате учитывают результат. Аммиак вызывает посинение лакмусовой бумажки; при выделении сероводорода на бумажке, пропитанной раствором, содержащим ацетат свинца, бикарбонат натрия, происходит образование сульфата свинца - бумажка чернеет; индол вызывает покраснение бумажки, пропитанной горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты.

Работа № 2. Характер роста бактерий на питательных средах

(культуральные свойства)

Цель: изучить характер роста бактерий на плотной питательной среде - МПА.

Самостоятельная работа: описать культуральные свойства колоний,выросших на МПА, результаты внести в таблицу

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

Конец работы -

Эта тема принадлежит разделу:

Учебно-методический комплекс по «Микробиологии, вирусологии»

Гбоу впо тюмгма минздрава России.. кафедра микробиологии.. учебно методический комплекс..

Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ:

Что будем делать с полученным материалом:

Если этот материал оказался полезным ля Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:

Все темы данного раздела:

Методы создания анаэробных условий
1) Физические методы. Методы основаны на выращивании микроорганизмов в среде без воздуха Посев в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества: В качестве ред

К работе № 3
Культивирование вирусов Для культивирования вирусов используют: 1) Куриные эмбрионы. Куриный эмбрион - удобная модель для культивирования вирусов с целью получени

Самостоятельная работа во внеурочное время
Что изображено на фотографии? Цель применения устройства? Какие

Среда Эндо . К 100 мл нейтрального расплавлен­ного 3%-ного мясопептонного агара прибавляют 1 мл 10%-ного водного раствора кристаллического углекисло­го натрия, выдерживают в текучепаровом аппарате в те­чение10 мин при температуре 100° С, охлаждают до 60° и стерильно прибавляют 1 г химически чистой лактозы, растворенной в 5 мл стерильной воды, и смесь фуксина с безводным сульфитом натрия. Смесь готовят следую­щим образом. Растворяют 0,5 г сульфита натрия в 5 мл стерильной воды и добавляют к 1 мл насыщенного спир­тового раствора основного кристаллического фуксина до тех пор, пока жидкость не станет бесцветной или слегка розоватой. Обесцвеченную смесь фуксина с сульфитом добавляют к расплавленному агару, и последний прини­мает розоватый цвет. После тщательного перемешивания (следят за тем, чтобы не образовывалась пена) среду разливают по чашкам. При остывании среда делается цветной, в толстых слоях имеет розоватый оттенок. На этой среде можно легко отличить кишечную палочку, паратифозных бактерий.

Готовят среду перед посевом. Во избежание покраснения ее защищают от света. Выпускается в виде сухого порошка. Способ приготовления указывается на этикетке.

Среда Гисса . Для изготовления индикатораАндредэ берут 100 мл дистиллированной воды, 0,5 г фуксина кислого и 16 мл 4%-ного водного раствора едкого натра. Выдержи­вают на водяной бане 10 мин. Хранят в темном месте.

Среду с индикатором Андредэ приготовляют следую­щим образом. Готовят пептонную воду. Для этого берут 1% пептона и 0,5% поваренной соли на определенный объем дистиллированной воды. Кипятят до растворения пептона, фильтруют через бумажный складчатый фильтр, устанавливают рН 7,0-7,2. После подщелачивания 10%-ным раствором NаОН снова кипятят в течение 10 мин, фильтруют и к готовой 1%-ной пептонной воде (рН 7,0-7,2) добавляют 1% индикатора Андредэ. К среде с индикатором добавляют требуемые углеводы или многоатомные спирты в количестве 0,5% - 1% (лак­тозу, глюкозу, сахарозу, маннит, дульцит и др.). Среды разливают по пробиркам, снабженным для учета обра­зования газа бродильными трубочками. Вместо трубо­чек иногда помещают кусочки ваты - 0,02 г на пробир­ку. Проводят дробную стерилизацию при температуре 100° С в течение 20 мин три дня подряд.

Правильно приготовленная среда имеет соломенно-желтый цвет.

Среда Кесслера . В 1 л водопроводной воды вносят 50 мл свежей бычьей желчи и 10 г пептона. Кипятят на водяной бане 15 мин, постоянно взбалтывая. После полного растворения среду фильтруют через вату и добавляют 10 г лактозы. Доводят рН до 7,7. К 1 л среды добавляют 4 мл 1 %-ного водного раствора генцианвиолета и разливают в пробирки с поплавками. Стерили­зуют в автоклаве при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 15 мин.

Определение рН питательных сред

Для культивирования микробов на искусственных питательных средах особое значение имеет концентрация водородных ионов, так как каждый вид микроба может развиваться только при определенной кислотности или щелочности. Большинство бактерий приспособлено к росту и размножению в нейтральной или слабощелочной среде (рН 7,0-7,6).

Для определения реакции питательной среды применяют два метода: электрометрический (с помощью рН-метра) и колориметрический. В лабораторной прак­тике чаще всего используется наиболее простой колориметрический метод по Михаэлису, основанный на изменении цвета индикатора вследствие диссоциации его в зависимости от концентрации водородных ионов в среде. При определении рН по Михаэлису применяют индикаторы нитрофенолового ряда. Ввиду того, что для выращивания микробов готовят среды слабощелочной реакции, при определении рН среды в качестве индикатора используют метаннитрофенол, который позволяет определять рН в пределах от 6,8 до 8,4. Растворы индикатора готовят на дистиллированной воде и хранят во флаконах из темного стекла с притертой пробкой.

Контрольные вопросы :

Состав питательных сред.

Как культивируют в лабораторных условиях микроорганизмы?

Какие бывают питательные среды по консистенции?

Как различают питательные среды по происхождению?

Плотные питательные среды и их характеристика.

Сухие питательные среды и их характеристика.

Углеводные питательные среды, их характеристика.

Автоклавирование.

Стерилизация текучим паром.

Пастеризация.

Стерилизация фильтрованием.

Как готовят МПБ, МПЖ, МПА?

Среда Штерна. Используют для дифференциации сальмонелл. К 1000 см 3 МПБ или бульона Хоттингера добавляют 2,5 см 3 10%-ного насыщенного спиртового раствора основного фуксина, 16,6 см 3 10%-ного водного раствора натрия сульфита (Na 2 S0 4) и 10 см 3 глицерина. Разлива­ют по пробиркам и стерилизуют 15 мин при 112° С. Готовая среда имеет желтую окраску. Если испытуемая культура относится к S. typhimurium, которая способна ферментировать глицерин, то среда приобретает фиоле­товый оттенок.

Среда Биттера. Используют для дифференциации сальмонелл. В 1000 см 3 дистиллированной воды растворяют 0,05 г пептона, 0,5 г на­трия цитрата, 5 г натрия хлорида, 5 г рамнозы (или арабинозы). Кипятят на водяной бане 3-5 мин, фильтруют через бумажный фильтр. Разливают по пробиркам и стерилизуют 30 мин при 112° С или текучим паром 3 дня под­ряд по 30 мин. Если испытуемая культура относится к сальмонеллам, спо­собным ферментировать рамнозу или арабинозу (S. typhimurium), то при добавлении к суточной культуре (выращенной на данной среде) 2 капель 0,5%-ного спиртового раствора метилового красного среда приобретает красную окраску.

Среда для посева по Свену -Гарду. Используют для выявления у саль­монелл специфической фазы жгутикового антигена. К 1000 см 3 МПБ или бульона Хоттингера добавляют 8 г агара и раство­ряют путем кипячения на водяной бане. Устанавливают рН 7,2-7,4, филь­труют через бумажный фильтр и стерилизуют 30 мин при 121° С.

Среды с аминокислотами. Используют для определения способности энтеробактерий в анаэробных условиях расщеплять левовращающие ами­нокислоты - лизин, орнитин, аргинин. В 600 см 3 дистиллированной воды растворяют 5 г пептона и 1 г глюкозы, устанавливают рН 6,0-6,1. Приготовленный раствор разливают по 150 см 3 в четыре колбы. В каждую из трех колб вносят по 10 г одной из аминокислот. Четвертая колба остается в качестве контрольной. Содержимое всех колб кипятят на водяной бане 5-10 мин, устанавливают рН 6,0-6,1. Во все че тыре колбы вносят по 0,6 см 3 1,6%-ного спиртового раствора бромкрезоло-вого пурпурного или бромтимолового синего и по 5 см 3 0,1%-ного спиртово­го раствора крезолового красного. Разливают в агглютинационные пробир­ки по 2-3 см 3 и стерилизуют 30 мин при 110° С.

Для проведения теста в пробирки, содержащие аминокислоту, и в конт­рольную пробирку засевают испытуемую культуру, после чего заливают стерильным вазелиновым маслом (слоем толщиной 10 мм) и инкубируют. Учет проводят в течение 4 сут. При положительной реакции среды с амино­кислотами приобретают фиолетовую или синюю (в зависимости от индика­тора) окраску, в контрольных пробирках среда имеет желтую окраску.

Состав 1,6%-ного спиртового раствора бромкрезолового пурпурного: бромкрезоловый пурпурный - 1,6 г, спирт этиловый 96° - 100 см 3 .

Состав 0,1%-ного спиртового раствора крезолового красного: крезоловый красный - 0,1 г, спирт этиловый 96° - 100 см 3 .

Среды, содержащие органические кислоты. Используют для дифферен­циации сальмонелл по их способности расщеплять органические кислоты (тартраты, мукаты, натрия цитрат). В 1000 см 3 дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, добавля­ют 8,5 см 3 0,1 Н раствора натрия гидроокиси, 12 см 3 0,25%-ного водного ра­створа бромтимолового синего, 10 г D-тартрата (или одну из следующих кислот: 5 г L-тартрата, 5 г мезотартрата, 10 г муката, 10 г натрия цитра­та). Устанавливают рН 7,4, разливают в пробирки и стерилизуют 20 мин при 112° С. Готовая среда синезеленого цвета. При положительной реакции в процессе инкубации среда с культурой приобретает зелено-желтую окраску.

Для получения более четких результатов в конце срока инкубации в пробирки с сомнительной или отрицательной реакцией добавляют несколь­ко капель насыщенного раствора ацетата свинца, в результате при отрица­тельной реакции выпадает обильный осадок (до 2 / 3 объема среды), при по­ложительной - выпавший осадок незначителен.

Среда с триптофаном. Используют для определения у бактерий нали­чия триптофандезаминазы. В 1000 см 3 дистиллированной воды растворяют 2 г DL-триптофана. Устанавливают рН 6,7-6,9. Для определения способности бактерий к дезаминированию триптофана испытуемую агаровую культуру бакте­риологической петлей вносят в пробирку с 0,5 см 3 раствора триптофана и инкубируют 30 мин при 37° С, после чего вносят
1 каплю 10%-ного водного раствора железа хлористого трехвалентного (FeCl 3). При поло­жительной реакции среда приобретает темно-красную окраску, при от­рицательной - желтую.

Среда с калием цианидом. В 1000 см 3 дистиллированной воды раство­ряют 10 г пептона, 5 г натрия хлорида, 0,225 г калия дигидрофосфата (КН 2 Р0 4), 5,64 г натрия гидрофосфата (Na,HP0 4). Устанавливают рН 7,6, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют 30 мин при 112° С. Пос­ле стерилизации быстро охлаждают. Среду этого состава используют в качестве контрольной. Непосредственно перед применением к 100 см 3 сре­ды асептически добавляют 1,5 см 3 свежеприготовленного 0,5%-ного вод­ного раствора калия цианида (KCN), разливают по пробиркам и закры­вают корковыми пробками.

Пробу считают положительной, если через 24-48 ч после посева куль­туры в среде заметно помутнение или опалесценция. При отрицательном результате среда остается абсолютно прозрачной, в то время как в конт­рольной пробирке заметно помутнение.

Среда Клиглер. Используют для определения образования сероводорода. В 1000 см 3 МПБ растворяют при кипячении 20 г пептона, 5 г натрия хло­рида, 0,4 г натрия сульфида, 0,08 г натрия тиосульфата, 20 г агара. Устанав­ливают рН 7,8, затем снова кипятят, фильтруют через бумажный фильтр и добавляют 0,5 г железа сернокислого, растворенного в небольшом количе­стве воды, 10 г лактозы, 1 г глюкозы и 12 см 3 0,2%-ного раствора фенолрота в 50%-ном спирте. Среду разливают по 6-7 см 3 в пробирки и стерилизуют 30 мин при 112° С. Среда имеет оранжево-красную окраску. При образовании сероводорода среда окрашивается в черный цвет.

Среда Кларка. Используется для постановки реакции Фогес-Проскауэра и пробы с метиловым красным для определения окисления глюкозы с образованием 2-кетоглюконата. В 100 см 3 дистиллированной воды растворяют 0,5 г калия гидрофосфа­та (К 2 НР0 4), 0,7 г пептона, 0,5 г глюкозы. Кипятят 2-3 мин, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 6,9, разливают по пробиркам и стерилизуют 15 мин при
111° С.

Реакцией Фогес-Проскауэра выявляют промежуточный продукт рас­щепления глюкозы - ацетилметилкарбинол (ацетоин). Для этого испытуе­мую культуру выращивают на среде Кларка 4-5 дней в 2 пробирках. Одну пробирку культивируют при 25° С, другую при 37° С. Из обеих пробирок по 1 см 3 культуры переносят в другие пробирки и добавляют 0,6 см 3 5%-ного спиртового раствора а-нафтола, смесь перемешивают. Затем добав­ляют 0,2 см 3 .40%-ного водного раствора КОН. Тщательно перемешивают и инкубируют 1 ч.

Учет реакции проводят через 15 и 60 мин. Положительная реакция - вишневое окрашивание среды.

Тестом с метиловым красным устанавливают снижение рН среды при расщеплении глюкозы до 4,4-6,0. Раствор метилового красного готовят добавлением к 0,1 г метилрота 300 см 3 95%-ного этанола. После растворения красителя добавляют 200 см 3 дистиллированной воды.

Для постановки теста в пробирку с 5 см 3 среды Кларка вносят петлю испытуемой культуры и инкубируют 2-5 сут при 25° С. Затем добавляют 5-6 капель реактива метиловый красный и следят за изменением окраски. При положительном результате (рН 4,0-6,0) среда приобретает красный цвет. При отрицательном результате (рН 6,0-7,0) среда приобретает жел­тый цвет.

Среда с мочевиной по Кристенсену. Используют для определения спо­собности бактерий к гидролизу мочевины (уреазная активность) с образо­ванием аммиака и углекислоты. В 1000 см 3 дистиллированной воды растворяют 1 г пептона, 5 г натрия хлорида, 2 г калия дигидрофосфата (КН 2 Р0 4), 20 г агара. Смесь стерилизу­ют 20 мин при 115° С. Затем вносят 1 г глюкозы и 6 см 3 0,2%-ного раствора фенилрота, стерилизуют текучим паром 1 ч, охлаждают до 50° С и асептичес­ки добавляют 100 см 3 20%-ного водного раствора мочевины, стерилизован­ного фильтрацией. Среду разливают по пробиркам и скашивают.

Испытуемую культуру засевают на поверхность скошенного агара и культивируют 1-4 сут. Положительный результат (защелачивание сре­ды) - красно-малиновое окрашивание среды.

Среда Симмонса. Используют для определения способности бактерий утилизировать цитрат как единственный источник углерода. Состав: агар - 20 г, NaCl - 5 г, MgS0 4 х 7Н 2 0 - 0,2 г, К 2 НР0 4 - 1 г, NH 4 х Н 2 Р0 4 - 1 г, C 6 H 5 0 ? Na 3 х 5Н 2 0 - 3 г, бромтимоловый синий - 0,08 г, вода дистиллированная - 1000 см 3 .

В дистиллированной воде растворяют агар. Соли растворяют отдельно в небольшом объеме воды и затем смешивают с агаром, до объема 1000 см 3 . Устанавливают рН 7,2, добавляют 40 см 3 0,2%-ного водного раствора бромтимолового синего. Среду перемешивают, разливают в пробирки по 5-7 см 3 и стерилизуют 15 мин при 121° С. После автоклавирования агар ска­шивают.

Испытуемую культуру засевают на поверхность агара и инкубируют. При положительном результате отмечают рост культуры на среде и измене­ние ее цвета с оливкового на синий.

Среда с алгинатом натрия. Используют для определения способности бак­терий утилизировать натрия алгинат как единственный источник углерода. Состав среды аналогичен составу среды Симмонса, но вместо натрия цитрата вносится 2,5 г натрия алгината. Положительным считают изменение цвета среды. Микроорганизмы, не обладающие способностью усваивать натрия алгинат, на данной среде не растут.

Среды Гисса. Используют для изучения способности ферментации угле­водов с образованием кислоты и газов. Состав: пептон - 10 г, натрия хлорид - 5 г, вода дистиллированная - 1000 см 3 , 0,1%-ный индикатор Андреде, углевод 0,5% (адонит, глицерин, сор­бит, дульцит, целлобиоза, раффиноза, трегалоза, салицин, арабиноза, мальто­за, рамноза, ксилоза) или 1,0% (глюкоза, лактоза, маннит, сахароза).

В дистиллированной воде растворяют навески пептона, натрия хлорида, добавляют индикатор, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,1-7,2 и стерилизуют 15 мин при 111 ° С. Затем добавляют углевод. Приготовленную среду разливают по пробиркам и стерилизуют
15 мин при 110° С.

Среда для выявления фенилаланиндезаминазы. Состав: сухой дрожжевой экстракт-3 г, натрий хлористый - 5 г, L-фенилалапин - 1 г, Na 2 HP0 4 - 1 г, агар - 12 г, вода дистиллированная - 1000 см 3 . Смешивают воду и дрожжевой экстракт, нагревают, добавляют компо­ненты и кипятят до расплавления агара, рН среды 7,0-7,2. Горячую среду фильтруют, разливают в пробирки по 2-3 см 3 и стерилизуют 30 мин при 112° С. Среду скашивают.

Испытуемую культуру засевают штрихом по поверхности агара и через сутки инкубации добавляют на поверхность культуры несколько капель 10%-ного водного раствора железа хлорида (FeCl 3). При дезаминировании фенилаланина среда окрашивается в зеленый цвет, при отрицательном результате сохраняется желтое окрашивание.

Среда для выявления β-галактозидазы. В 100 см 3 расплавленного и охлажденного до 40-45° С МПА асепти­чески добавляют 20 см 3 1%-ного водного раствора О-нитрофенил-β-D-галактопиранозид. Среду разливают по пробиркам.

Испытуемую культуру засевают уколом петлей до дна пробирки. Посевы инкубируют 24 ч при 37° С.

При положительной реакции среда окрашивается в желтый цвет одним из конечных продуктов гидролиза О-нитрофенил-β-D-галактопиранозида О-нитрофенолом.

Среды для выявления лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы и чргининдегидролазы. Состав: мясная вода - 400 см 3 , пептон - 5 г, глюкоза - 1 г, вода дистиллированная - 600 см 3 , 0,1%-ный спиртовой раствор крезолового красного - 5 см 3 , 1,6%-ный спиртовой раствор бромкрезолового пурпурного - 0,6 см 3 , L-лизин (или орнитин, или аргинин) -10 г.

Мясную воду, пептон, глюкозу и дистиллированную воду смешивают, устанавливают рН 6,0-6,1. Вносят аминокислоту, кипятят 8-10 мин, до­бавляют индикатор и разливают в агглютинационные пробирки по
3 см 3 . Стерилизуют 30 мин при 110° С. Цвет среды розовый.

Испытуемую культуру засевают в среды с аминокислотами (опыт) и среду безаминокислоты (контроль). Во все пробирки вносят стерильное вазелиновое иасло до получения слоя в 4-5 мм. Пробирки инкубируют 4 дня при 37° С.

При положительной реакции (защелачивание среды) наблюдается синee окрашивание в опытных пробирках и желтое - в контрольной.

Среда для определения пиразинамидазной активности у Y.enterocolitica . Состав: трипсинизированный соевый агар - 30 г, дрожжевой экстракт сухой - 3 г, пиразинкарбоксиамид - 1 г, трисмалат буфер 0,2 М, рН 6,0-1000 см 3 .

Составные части среды смешивают и подогревают на водяной бане до их растворения. Разливают по 5 см 3 в пробирки, стерилизуют 30 мин при 112° С и скашивают.

Среда для определения калъцийзависимости роста у Y. Enterocolitica . В качестве питательной основы используют коммерческую среду для определения чувствительности бактерий к антибиотикам (агар АГВ).

К стерильному расплавленному и охлажденному до 50° С агару добав­ляют (из расчета на 100 см 3) 8 см 3 0,25 М стерильного натрия щавелевокис­лого, среду тщательно перемешивают и вносят 4 см 3 0,5 М стерильного раствора магния хлорида. Готовую среду разливают по чашкам Петри.

Определение индолообразования. Испытуемую культуру выращивают в пробирке с бульоном Хоттингера. В пробирку с культурой вносят 2-3 капли эфира, тщательно ее встря­хивают, оставляют в покое до отстаивания на поверхности среды слоя эфи­ра. Осторожно добавляют
0,5 см 3 реактива Эрлиха, выдерживают 5 мин и учитывают результат. При наличии индолообразования слой эфира приоб­ретает розово-красный цвет.

Для приготовления реактива Эрлиха в 95 см 3 96%-ного этанола раство­ряют 1 г парадиметиламинобензальдегида и добавляют 20 см 3 концентри­рованной хлористоводородной кислоты (НС1).

Дифференциально-диагностические среды - это специальные смеси питательных веществ, применяемые для определения видовой принадлежности микробов и изучения их свойств. При росте бактерий на дифференциально-диагностических средах протекают химические процессы, обусловленные наличием у микробной клетки различных . Одни из них способны расщеплять , другие - , третьи - вызывать реакции окисления и восстановления и т. д. Благодаря действию ферментов в дифференциально-диагностической среде происходят соответствующие изменения.

Дифференциально-диагностические среды можно разделить на четыре основные группы.

Рис. 1-6. Различные формы расщепления желатины. Рис. 7 - 9. Жидкая среда с углеводом и индикатором Андраде: рис. 7 - отсутствие ферментации; рис. 8 - ферментация с образованием кислоты; рис. 9 - ферментация с образованием кислоты и газа. Рис. 10 - 12. Полужидкая среда с углеводом и индикатором BP (из сухой питательной среды): рис. 10 - отсутствие ферментации; рис. 11 - ферментация с образованием кислоты; рис. 12 - ферментация с образованием кислоты и газа. Рис. 13-15. Искусственная лакмусовая сыворотка по Зейтцу: рис. 13 - отсутствие ферментации; рис. 14 - ферментация с образованием кислоты; рис. 15 - ферментация с образованием . Рис. 16 и 17. Молоко с метиленовым синим: рис. 16 - отсутствие редукции; рис. 17 -редукция. Рис. 18 и 19. Среда Симонса: рис. 18 -отсутствие ассимиляции цитрата; рис. 19 - ассимиляция цитрата. Рис. 20 - 24. Лакмусовое молоко: рис. 20 - отсутствие ферментации; рис. 21 - ферментация с образованием кислоты; рис. 22 - ферментация с образованием щелочи; рис. 23 - пептонизация; рис. 24 - редукция. Рис. 25. Разжижение свернутой (в проходящем свете). Рис. 26. Гемолиз на кровяном агаре (в проходящем свете). Рис. 27. Кровяная среда с теллуритом калия.

1. Среды, содержащие белок и выявляющие способность микробов расщеплять белки (протеолитические Свойства): мясо-пептонная «столбиком», свернутая лошадиная или бычья сыворотка, молоко, кровяной агар. При посеве бактерий проколом в мясо-пептонную желатину, «столбиком» в случае расщепления белка наблюдают разжижение среды. При посеве на среду со свернутой сывороткой расщепление белка определяют по разжижению среды и образованию углублений на ее поверхности. Расщепление микробом молока выявляется просветлением или растворением первоначально свернувшегося молока. Наличие гемолитической активности исследуемой культуры проверяют посевом ее в на специальный кровяной агар. В результате разрушения вокруг колоний (например, гемолитического или ) образуются зоны просветления.

2. Среды для выявления способности микробов расщеплять углеводы и высокоатомные (Эндо среда, Левина среда, Расселла среда, Дригальского - Конради среда, Рапопорт - Вайнтрауба среда, Шустовой среда). Для выявления этих свойств микроорганизмов применяют также «пестрый» ряд, т. е. серию пробирок, содержащих , включающие различные углеводы, многоатомные спирты и индикатор. В качестве индикаторов пользуются лакмусовой настойкой или бромтимоловым синим. Разложение какого-либо из углеводов с образованием кислоты выявляют по изменению цвета индикатора, образование газа- по заполнению газом и всплыванию специального стеклянного поплавка в жидкой среде. Или применяют полужидкие Гисса среды (см.) с 0,5% агара с соответствующими сахарами и индикатором Андраде. После посева микроба на эти среды образование кислоты выявляют покраснением среды, а образование газа - по появлению его пузырьков в агаре или по разрыву и сдвигу вверх агарового столбика. К дифференциально-диагностическим средам второй группы относят также крахмальный агар, служащий для определения способности микробов расщеплять крахмал, среду Кларка и др.

3. Среды, на которых выявляется способность микробов обесцвечивать красители, добавленные к бульону: метиленовый синий, тионин, лакмус, нейтральный красный или другие (среда Ротбергера, среда Омелянского). К третьей группе относят также среды с нитратами, служащие для определения способности микробов восстанавливать соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой кислоты (нитриты) и далее в аммиак или свободный азот.

4. Среды, выявляющие способность микробов усваивать вещества, которые не усваиваются другими микробами, например среда с лимоннокислым натрием (цитратный агар Симонса) для отличия кишечной палочки, которая лишена способности ассимилировать эту среду, от других бактерий кишечной группы или среда с олеиновокислым натрием для дифференциации дифтерийной палочки от ложно дифтерийной и дифтероидов (агар Энжеринга).

К дифференциально-диагностическим средам относят также среды для дифференциации анаэробов, теллуритовые среды для дифференциации дифтерийных бактерий, среды с мочевиной, щелочные среды (Дьедонне агар) для культивирования холерного вибриона и др. См. также Идентификация микробов.

Среда Эндо. Состоит из МПА с добавлением 1% лактозы и обесцвеченного сульфитом натрия основного фуксина (индикатор). Среда Эндо имеет слаборозовый цвет. Используется в диагностике кишечных инфекций для дифференциации бактерий, разлагающих лактозу с образованием кислых продуктов, от бактерий, не обладающих этой способностью. Колонии лактозопозитивных микробов (кишечная палочка) имеют красный цвет вследствие восстановления фуксина. Колонии лактозонегативных микроорганизмов - сальмонелл, шигелл и др. -бесцветны.

К дифференциально-диагностическим средам относятся короткий и развёрнутый пёстрый ряд. Он состоит из сред с углеводами (среды Гисса), МПБ, молока, мясопептонной желатины.

Среды Гисса готовятся на основе пептонной воды, к которой прибавляются химически чистые моно-, ди- или полисахариды (глюкоза, лактоза, крахмал и др.).

Для обнаружения сдвигов рН в результате образования кислот и разложения углевода в среды прибавляют индикатор. При более глубоком расщеплении углеводов образуются газообразные продукты (СО 2 , СН 4 и др.), которые улавливаются при помощи поплавков - маленьких пробирочек, опущенных в среду кверху дном. Среды с углеводами могут готовиться и плотными - с добавлением 0,5-1% агар-агара. Тогда газообразование улавливается по образованию пузырьков (разрывов) в столбике среды.

На МПБ, входящем в пёстрый ряд, обнаруживают продукты, образующиеся при расщеплении аминокислот и пептонов (индол, сероводород). Сероводород обнаруживается путем помещения в МПБ после засева культуры полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца. При расщеплении аминокислот, содержащих серу, выделяется сероводород, бумажка чернеет за счёт образования сернистого свинца. Для определения индола можно использовать сложный индикатор. Индол образуется при расщеплении триптофана, и его можно обнаружить при добавлении к культуре, выращенной на МПБ, этого индикатора. При наличии индола МПБ окрашивается в зеленый или синий цвет.

В практических бактериологических лабораториях широко применяют микро- и экспресс-методы для ориентировочного изучения биохимических свойств микроорганизмов. Для этой цели существует множество тест-систем. Наиболее часто используют систему индикаторных бумаг (СИБ). СИБы представляют из себя диски фильтровальной бумаги, пропитанные растворами сахаров или других субстратов в сочетании с индикаторами. Такие диски опускают в пробирку с выросшей в жидкой питательной среде культурой. По изменению цвета диска с субстратом судят о работе фермента. Микро-тест системы для изучения идентификации энтеробактерий представлены одноразовыми пластиковыми контейнерами со средами, содержащими различные субстраты, с добавлением индикаторов. Посев чистой культуры микроорганизмов в такие тест-системы позволяет быстро выявить способность бактерий утилизировать цитраты, глюкозу, сахарозу, выделять аммиак, индол, разлагать мочевину, лизин, фенилаланин и т.д.

Сухие среды. Питательный агар, а также основные дифференциально-диагностические среды выпускаются в настоящее время в виде сухих препаратов, содержащих все необходимые составные части. К таким порошкам нужно добавить только воду и сварить, а затем, после разливки, простерилизовать.